你應該知道關於圖像噪點有哪些

這是用輕質板材顯微鏡(超顯微鏡)獲得的小鼠胚胎的最大強度投影。血管用Alexa 488(綠)標記,神經元結構和上皮細胞分別用Alexa 568(紅)和Alexa 633(藍色)標記。由德國比勒費爾德LaVision BioTec GmbH提供。

光照不足會導致許多照片和視頻出現雪花點,即噪點。導致這種現象的原因有多種。在特定應用中正確選擇或者使用相機可以幫助消除這些不良影像。攝影師在購買相機時,圖元數、刷新率和靈敏度都是購買的決定性標準,不過對於顯微鏡使用者以及生命科學家也感興趣。不幸的是,還有另一種標準,常常被他們忽視:攝像機的噪點行為,或者更準確地說:相機的信噪比(SNR)。尤其是在專業應用中,SNR是影響圖像品質的一個主要因素。此外,它是引起大多數人對相機的誤解的原因。
 
自然因素

最大的誤區在於:有噪點的相機都不好。但並不是所有的噪點是相同的。記錄圖像時,不同來源的幹擾都會引起圖像噪點。有些噪點可以歸究於照相機的品質,而其他的則是自然情況下的結果,並不能防止 - 相反,它們甚至是可取的。

光子雜訊是一種“好”的或可取的雜訊。它描述了光能量的最小單位-光子的行為不能精確地按照量子物理學定律來預測的現象。因此,由攝像頭晶片測得的發光強度有所波動,即使被攝物體的亮度是恒定的。這種不可預測性顯示在圖像的噪音上 - 這是一件好事。光子雜訊增大成比例的信號,即當一定數目的光子到達相機晶片- 同時感測器晶片也獲得有大量的光。因此,光子雜訊作為一種自然現像是始終存在的,雖然它只能通過相同照明場景的的連續兩個圖像的圖元與圖元的比較來感知。

不幸的是,還存在“不良”或不希望有的雜訊。它由相機和其他多方面的原因引起。主要來源是圖像感測器,它將在每個圖元中的光入射為的電荷載體的相應數量。

這樣的電荷載體,即使完全沒有入射光,也會因為熱量或在半導體材料的缺陷而產生。另一個影響是由電荷載體或電壓通過晶片引起的傳輸雜訊。如果該信號電壓被放大,並通過類比 - 數位轉換器轉換為數位信號,這將導致相機的附加雜訊,統稱為讀出雜訊。該信號是不希望有的 - 好在它在正常運行條件下通常是不變的(只要是在室溫下沒有顯著波動)。如果我們在整個動態範圍檢查攝像機的信號與雜訊的比值,可以清楚地看到光子雜訊占主導地位,開始以感測器的最大光的10%到15%的水準吸收容量。另一方面相機的雜訊在低光照水準時是最強的,往往對深色圖像產生不利影響。

那麼,用戶應該注意什麼?盡可能將相機噪音減到最低?原則上是的,但這種做法只在一半的情況下是可行的。為了獲取最佳圖像,我們必須考慮這個問題的性質:光線太暗抑或太亮?

光照有限的拍攝條件

在光照有限的環境下工作的用戶就是“噪音是最大問題”的體驗者。其中一個極端的例子就是使用現代顯微鏡程式的單分子測量。這是因為樣品中通常標記有螢光染料,發出非常少的光。

然而,穩定的和精確的發光強度必須被測量。這類應用的一些例子是超解析度顯微鏡,單平面照明顯微鏡(SPIM)和結構照明顯微鏡(SIM)。此時相機的噪點是必須最小。低照應用的相機中獲取最佳圖像的感測器的平均讀出噪音為1.1電荷載體。這意味著每一個曝光中每個圖元只有大概一個“壞”電荷載體。在這種情況下,即使是最弱的光,生成每個圖元僅有少數載體,也可與背景雜訊充分對比。

同樣重要的是高量子效率。這指的是圖像感測器將盡可能多的光子轉換成電荷載體的能力。如今一個好的量子效率值是70%,這意味著感測器需要一個平均不到兩個光子來創建一個電荷載體。由於大多數圖像感測器將每個圖元的表面的主要部分用於其他功能,使之不能用於光轉化,而微透鏡收集光並將其聚焦在感光區域。同時有相機具有甚至達90%以上的量子效率。這些攝像機將幾乎所有的光子轉換成電荷載體 - 儘管有其他缺點。

具有高亮度的研究物件的拍攝情況是完全不同的。在這種情況下,相機雜訊幾乎沒有意義。然而,這種能夠做到均勻照明的研究物件極少。通常情況是,光亮區域與黑暗區域在圖像中交替存在。在流動系統中所使用的流量測量技術就是一個例子。在這裏,寬內場動態範圍非常必要。這指的是信號 - 雜訊比,即最低的信號之間的比率,限制了讀出雜訊,以及全容量的最高的信號。後者是由於單個圖元的電荷載體的最大容量,即滿阱或飽和容量。

大圖元圖像感測器一般具有較高的滿阱容量,而較小的傳感器具有較低的讀出雜訊。從長遠來看,由此產生的動態範圍是決定性的。以下計算用來說明這一點:以10的讀出雜訊和30,000載體的滿阱容量,動態比為1〜3000。如果讀出的雜訊只有兩個電荷載體,換句話說,動態比為1〜15000。那將對應於14位,並提供顯著好的由光到暗的色調等級。

顯微鏡的低發光強度

在現代顯微鏡程式裏很值得熟悉這些關係。在照射時發出光的染料,被用來標記生物-例如標記蛋白質。可為細胞提供更多的光來接收來自所述生物標誌物更多的信號,且只有達到一定的程度才能起作用,否則會破壞細胞。原因在於,許多染料是光毒性的:當它們被照射時,它們對細胞將起毒性作用。因此,小劑量照射應保持盡可能低。建議使用高靈敏度的照相機,便於用戶容易地識別信號。

在超高解析度顯微鏡中,用戶能夠看到細胞的標記部分,或生物標誌物的信號。因此細胞壁或細胞核與染料結合到一起。化學或物理技巧是用來防止所有分子同時發光。由於解析度不足(衍射極限),用戶將在顯微鏡上看到一個聚焦的亮點。通過檢查這個亮點也能夠確定其品質中心,並能夠找到分子的位置資訊。如果亮點在後面的圖像的同一位置,該亮點就會接收到一個更高的值。重複這個過程10000次,最後將獲得一個累積圖像。根據所使用的程式,所得到的圖像可達到10納米解析度,這比常規的顯微鏡圖像的解析度顯著提高。這可以解釋為什麼這種技術被稱為超高解析度顯微鏡。

由於在這種應用中用到的光非常少,新的科學CMOS圖像感測器在這方面是有優勢的,原因是它們同樣靈敏和快速,可以在不到一分鐘的時間內創建一個圖像。

不同類型的顯微鏡,例如STORM(隨機光學重構顯微術),PALM(光活化定位顯微鏡)或GSD(Ground State Depletion)顯微鏡,將使用不同的方法來防止分子同時發光。

透明標準化資料

上面的例子說明,顯微鏡應用困難往往在於低光照條件。如何選擇合適的相機(高靈敏度或低雜訊)對於特定的應用是很重要的。但是,這並不總是容易的。在過去,許多相機廠商的資料表通常都很粗略,或不允許與其他廠商的資料進行比較。這就是為什麼歐洲機器視覺協會(European Machine Vision Association)於2005年推出了EMVA 1288標準(www.emva.org)。該標準定義了如何測量動力學,靈敏度,讀出雜訊和其他參數。這使得比較不同的製造商的資料成為可能 - 理論上。該標準是自願的,到目前為止,只有少數廠家願意透露必要的相關資料。它是由客戶來改變這一點 - 通過明確地要求資料符合EMVA 1288標準。

作者
Dr. Mona Clerico
Storymaker GmbH, Tübingen, Germany

Dr. Gerhard Holst (corresponding author via e-mail request)
PCO AG
Kelheim, Germany